چکيده

  سابقه و هدف

  کراتينوسيت يک مدل مناسب برای بيان ژن به صورت ex vivo برای رهاسازی سيستميک پروتئين است. با توجه به اين نکته عناصر کنترلی اختصاصی کراتينوسيت‌ها، گزينه‌های مناسبی برای بيان ژن با واسطه کراتينوسيت‌ها هستند. در پژوهش حاضر يک وکتور برای بيان اختصاصی پروتئين‌های نوترکيب در کراتينوسيت‌های اپيدرم با استفاده از پروموتر ژن کراتين‌ـ‌ 14 انسانی طراحی گرديد. توانايی پلاسميد ساخته‌شده به‌وسيله بيان cDNA فاکتور انعقادی IX انسان ی در کراتينوسيت‌های اوليه انسانی نشان داده‌شد.

  مواد وروش ها

  مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. با قرار گرفتن يک قطعه حاوی پروموتر ژن کراتين ـ 14 انسانی به جای پروموتر سيتومگالوويروس ( CMV ) در پلاسميد pcDNA3 ، پلاسميد بيانی phPK14H ساخته شد. در مرحله بعد cDNA فاکتور IX انسانی که از کتابخانه cDNA کبدی جدا شده بود، وارد پلاسميد بيانی شد و پلاسميد pK14hFIX ساخته شد و برای ترانسفکشن کراتينوسيت‌ها مورد استفاده قرار گرفت. کراتينوسيت‌های انسانی از پوست ختنه نوزادان جدا و با استفاده از محيط کشت عاری از سرم مخصوص کراتينوسيت‌ها کشت داده شدند. سلول‌های مزبور با پلاسميد نوترکيب جديد ساخته شده ( pK14hFIX ) با استفاده از فيوجين-6 ترانسفکت شدند. حدود 72 ساعت پس از ترانسفکشن، محيط کشت به‌دست آمده از سلول‌های ترانسفکت شده برای بررسی بيان فاکتور IX جمع آوری و سلول‌ها به محيط کشت انتخابی حاوی جنيتيسين منتقل شدند. ادامه کشت سلول‌های مزبور در محيط انتخابی منجر به پديدار شدن 9 کلنی شد که در ادامه هر يک به صورت جداگانه کشت داده شده و مورد مطالعه قرار گرفتند. بيان cDNA فاکتور IX با استفاده از آزمون انعقادی يک مرحله‌ای بر روی محيط‌های کشت و هم‌چنين انجام RT-PCR بر روی سلول‌های کراتينوسيت ترانسفکت مورد مطالعه قرار گرفت.

  يافته‌ها

  زمان‌های انعقاد به دست آمده از محيط‌های کشت سری‌های مختلف ترانسفکشن با کنترل‌های منفی مقايسه شد. فعاليت انعقادی فاکتور IX نوترکيب در محيط کشت کراتينوسيت‌های ترانسفکت شده قبل از تيمار جنيتيسين وپس از انتخاب کلنی‌ها با جنيتيسين نشان داده شد. بيان cDNA فاکتور IX در سلول‌های ترانسفکت شده هم‌چنين با انجام RT-PCR تاييد شد.

  نتيجه‌گيری

  نتايج اوليه ما نظريه‌ای که کراتينوسيت‌های انسانی قادر به توليد فاکتور IX فعال تحت کنترل پروموتر کراتين‌ـ14هستند را تاييد می‌کند. علاوه بر اين پلاسميد ساخته شده حاصل از اين تحقيق ابزار مناسبی برای بررسی بيان پروتئين‌هايی که از اهميت درمانی برخوردارند را در کراتينوسيت‌ها برای مطالعات مختلف بيوشيميايی و سلولی فراهم ساخته است.