بررسی بیان ژن‌های حفاظت سلولی TXNRD1 و GCLCپس از افزایش بیان Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بند ناف
حسین مهرابی حبیب‌آبادی1، فاطمه امیری2، الهام مسلمی3، مهریار حبیبی رودکنار4، محمد علی جلیلی5
چکیده سابقه و هدف سلولهای بنیادی مزانشیمی(MSCs) به علت خصوصیات منحصر به فرد، سلول‌هایی ایدهآل در زمینههای سلول درمانی و ژن درمانی می‌باشند.اما بقای کم آن‌ها پس از پیوند، استفاده از آن‌ها را محدود کرده است.هدف این مطالعه، بررسی بیان ژن‌های حفاظت سلولی شامل NQO1 ، TXNRD1، HO-1 ، GCLC پس از افزایش بیان Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی بود. مواد و روش‌ها در این مطالعه تجربی، MSCs بند ناف کشت داده شدند و پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 و پلاسمید فاقد ژن Nrf2 با استفاده از مادهFuGENE HD به داخل این سلول‌ها ترانسفکت شدند. پس از اعمال استرس به سلول‌ها، RNA استخراج شده و cDNA ساخته شد. آغازگرهای اختصاصی برای ژن‌های Nrf2 ، NQO1 ، TXNRD1 ، HO-1 ، GCLC با استفاده از نرم‌افزار 3Primer طراحی و بیان این ژن‌ها با روش RT-PCR بررسی شد. نتایج با استفاده از نرم‌افزار Image J2x و ANOVA کمی‌سازی و بررسی آماری گردید. یافته‌ها بیان Nrf2 در MSCs متعاقب ترانسفکشن افزایش داشت( 01/0(p < . افزایش بیان ژن‌های TXNRD1 و GCLC نیز در سلولهای ترانسفکت شده مشاهده شد(05/0 p< و 01/0(p< ولی بیان ژن‌های HO-1 و NQO1 در این سلول‌ها نسبت به کنترل تغییری نداشت. نتیجه گیری افزایش بیان Nrf2 موجب بیان GCLC و TXNRD1 در سلولهای بنیادی مزانشیمی شده و به نظر می‌رسد بخشی از اثرات حفاظتی شناخته شده Nrf2 تحت تاثیر بیان این ژن‌ها باشد. کلمات کلیدی:سلولهای بنیادی مزانشیمی، پروتئین Nrf2 انسانی، پروتئین TXNRD1انسانی
تاریخ دریافت : 30/10/93 تاریخ پذیرش : 16 /3 /94
1- کارشناس ارشد زیستشناسی سلولی مولکولی ـ دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شرق ـ تهران ـ ایران 2- PhD هماتولوژی آزمایشگاهی و بانک خون ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 3- PhD زیستشناسی سلولی و مولکولی ـ استادیار دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شرق ـ تهران ـ ایران 4- PhD زیست فن‌آوری پزشکی ـ دانشیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران 5- مؤلف مسئول: PhD شیمی دارویی ـ استادیار مرکز تحقیقات انتقال خون ـ مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون ـ تهران ـ ایران ـ صندوق پستی: 1157-14665
مقدمه مشکلات و محدودیت‌های موجود در استفاده از سلولهای بنیادی جنینی، توجه محققین به استفاده از سلولهای بنیادی بالغ را افزایش داده است(1). سلولهای بنیادی مزانشیمی(MSCs) از مهم‌ترین سلولهای بنیادی بالغین هستند(1). سلولهای بنیادی مزانشیمی، برای اولین بار در سال 1966 توسط پراکوا و فرایدانشتین طی جداسازی سلولهای استخوانی از مغز استخوان موش شناسایی شدند(2).این سلول‌ها،جمعیتی از سلولهای بنیادی چند توانه می‌باشند که از بافتهایی نظیر مغز استخوان،ماهیچه اسکلتی،مغز،بافت چربی،خون بندناف، خون محیطی و بافتهای پیوندی پوستی جدا میشوند(3). علی‌رغم تفاوتهای مختصر، توانایی تکثیر و خودنوسازی طولانی مدت، ریخت‌شناسی دوکی و فیبروبلاست مانند و توانایی تمایز به دودمان مزودرمی و حتی غیر مزودرمی از خصوصیات منحصر به فرد این سلول‌ها می‌باشند(4). از طرفی سلولهای بنیادی مزانشیمی با توانایی فرار از سیستم ایمنی میزبان، خاصیت تعدیل ایمنی و سهولت تکثیر در آزمایشگاه، سلولهای ایدهآلی برای سلول درمانی هستند. به طوری که امروزه پیوند سلولهای بنیادی مزانشیمی در درمان آسیبهای بافتی، انفارکتوس میوکارد، آسیب حاد کلیوی و سایر انواع بیماریها مؤثر می‌باشد(7-5). ولی طی فرآیندهای جمع‌آوری، کشت و پردازش، آسیبهای متعددی به سلولهای بنیادی مزانشیمی وارد می‌شود که بقا و عملکرد آن‌ها را در بدن کاهش میدهد. در برخی موارد یک روز پس از پیوند، کمتر از 1% سلولهای پیوند شده زنده باقی میمانند(9، 8). به کارگیری راه‌کارهای مناسب جهت افزایش مقاومت این سلول‌ها در برابر استرسهای موجود، درصد موفقیت پیوند سلولهای بنیادی مزانشیمی را افزایش میدهد. به نظر می‌رسد شناخت و تقویت مکانیسمهای حفاظتی این سلول‌ها، منجر به بقای بیشتر آن‌ها شود. یکی از راه‌کارهای مؤثر و قوی، دستورزی ژنتیکی سلولهای بنیادی مزانشیمی با عوامل محافظت‌کننده سلولی شناخته شده می‌باشد(9). یکـی از عوامل محفاظت‌کننده سلولی(Cytoprotective)، فاکتور نسخه‌برداری like 2 Nrf2 - (erythroid-derived 2) Nuclear factor است. این فاکتور نسخه‌برداری بقای سلولی را در مواجهه با استرسهای مختلف افزایش میدهد.Nrf2به طور طبیعی بیان شده و به پروتئینهای سیتوپلاسمی متصل می‌شود ودر اثر استرسهای گوناگون، به هسته سلول رفته و موجب بیان ژن‌های متعددی مانند آنزیم‌های مؤثر در فرآیند آنتی‌اکسیدان و سمزدایی سلولی می‌شود. Nrf2 ، نقش مهمی در حفاظت علیه استرس اکسیداتیو و آسیب سلولی ناشی از مواد شیمیایی دارد(13-10). تحت شرایط استرس، بیانNrf2افزایش یافته و موجب رونویسی از ژنهایی می‌گردد که باعث افزایش مقاومت سلولی میشوند. از جمله این ژن‌ها TXNRD1 ، GCLC ، GSTs ، UGT ، HO-1 و NQO1 هستند که اثرات سمیتزدایی و آنتیاکسیدانی داشته و در نهایت منجر به دفاع سلولی میشوند(18-14). NQO1 (1[quinone](P) H dehydrogenaseNAD)، ژن بیان‌کننده یک آنزیم اکسیدو ردوکتاز است که نقش مهمی در سمزدایی از کوئینون و مشتقات آن بر عهده دارد(19). هم چنین این آنزیم باعث ثبات و پایداری P53 می‌شود و از سلول‌ها در برابر آسیبهای اکسیداتیو محافظت می‌کند (20). ژن HO-1 (هم اکسیژناز-1)، موجب بیان آنزیم القایی در شرایط استرس سلولی شده و این آنزیم مولکول اکسیدکننده هم (Heme) را تجزیه نموده و محصولات جانبی هم چون CO ، بیلی‌روبین و Fe2+ را تولید مینماید(21). از مهم‌ترین عملکردهای HO-1 می‌توان به فعالیتهای آنتی‌اکسیدان، آنتیآپوپتوتیک و ضدالتهابی اشاره نمود(23، 22). ژن TXNRD1(Thioredoxin reductase 1)، ضمن عهده‌دار بودن نقش حیاتی در پاسخ بیولوژیک به استرس اکسیداتیو، از طریق کنترل فعالیت تیوردوکسین در کنترل تکثیر سلولی، بقای سلولی و آپوپتوز نیز دخیل می‌باشد(24). ژن GCLC(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic) آنزیم گلوتامات سیستئین لیگاز را رمزگذاری می‌کند. این آنزیم اولین عامل محدودکننده ساخت گلوتاتیون بوده و در پاسخ به استرسهای سلولی دخیل است(25). ژن‌های توصیـف شده از عوامل شناخته شده محافظت سلولی بوده و به‌عنوان ژن‌های فرودست Nrf2 مطرح هستند. در مطالعه‌های دیگر اثر افزایش بیان Nrf2 در افزایش مقاومت سلولی به شرایط استرس محیطی بررسی شده، اما تغییر بیان این ژن‌ها که احتمالاً به شناخت بهتر مکانیسم حفاظت کنندگی Nrf2 کمک می‌کند، کمتر مورد بررسی قرار گرفته است(28-26). با توجه به اطلاعات موجود و اهمیت این ژن‌ها در القای مقاومت سلولی، در این مطالعه بیان برخی از ژن‌های حفاظت سلولی مانند NQO1، TXNRD1، HO-1، GCLC پس از افزایش بیان Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی بررسی شد. به عبارت دیگر با بررسی بیان ژن‌های پایین دست Nrf2 برخی از مکانیسمهای احتمالی حفاظت سلولی Nrf2 تعیین گردید.
مواد و روش‌ها آمادهسازی سلولهای بنیادی مزانشیمی: این مطالعه از نوع تجربی بوده وجهت انجام آن از سلولهای بنیادی مزانشیمی بندناف استفاده شد. این سلول‌ها در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران از نمونه بندناف جداسازی و تعیین خصوصیت شده بودند (29). پاساژ سوم تا پنجم سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف از تانک ازت خارج شده و پس از ذوب شدن در محیط کشت سلولی DMEM-Low Glucose (اینویتروژن، آلمان) با 10%FBS (اینویتروژن، آلمان)، 1% پنی‌سیلین و استرپتومایسین (اینویتروژن، آلمان) در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5% Co2 کشت داده شدند. از آن جا که خصوصیت تمایزی این سلول‌ها به سه رده استخوان، چربی و غضروف همانند مارکرهای سطحی آن‌ها قبلاً تایید شده بود، تنها خصوصیات ریخت‌شناسی MSC های تکثیر یافته در آزمایشگاه، مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور MSC های بند ناف در محیط کشت مذکور کشت داده شدند. 5 روز بعد و پس از این که به صورت یک لایه سطح فلاسک را پوشاندند، خصوصیات شکلی آن‌ها با میکروسکـوپ نوری معکوس مورد بررسی و مشاهده قرار گرفت.
ترانسفکشن سلولهای بنیادی مزانشیمی: در این مطالعه از پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 (pcDNA3.1-Nrf2) که در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران تولید و صحت آن تایید شده بود استفاده شد(26). به منظور افزایش بیان Nrf2، حدود 300 هزار سلول بنیادی مزانشیمی در پلیت 6 خانهای کشت داده شدند. جهت انجام ترانسفکشن و طی سری آزمایش‌های متعدد، نسبت‌های مختلف از غلظت DNA پلاسمیدی و ماده FuGENE HD (رُوش، آلمان) با یکدیگر مخلوط شدند. در نهایت مخلوط 2 میکروگرم از DNA پلاسمیدی با 4 میکرولیتر از ماده ترانسفکشن ذکر شده به ازاء 300 تا 400 هزار سلول بنیادی مزانشیمی به عنوان مقدار بهینه جهت انتقال(ترانسفکت کردن) پلاسمید نوترکیب pcDNA3.1-Nrf2 و پلاسمید فاقد ژن Nrf2 (به عنوان گروه کنترل) به سلول‌ها انتخاب شد. از آن جا که پلاسمید استفاده شده دارای نشانگر پروتئین سبز فلورسنت(GFP) نبود تا درصد و یا موفقیت ترانسفکت شدن با استفاده از مشاهده سلول‌ها در زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی شود، طبق دستورالعمل کیت در زمان‌های مختلف پس از ترانسفکشن(24‚ 48 و 72 ساعت)، بیانNrf2در هر دو گروه سلولی ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب و پلاسمید فاقدNrf2 با روش RT-PCR بررسی شد. از طرفی جهت القای بیان Nrf2، سلولهای ترانسفکت شدهبه مدت 1 ساعت در معرض اشعه UV قرار گرفتند. پس از تعیین بهترین زمان ترانسفکشن که منجر به بیان بیشتر Nrf2 شده بود، بیان ژن‌های NQO1 TXNRD1 ، GCLC ، HO-1 نیز با با روش RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت.
PCR ترانس‌کریپتاز معکوس(RT-PCR) : پس از ترانسفکشن سلول‌ها در زمان مناسب و اعمال استرس اشعه UV، مقدار RNA برابر از سلولهای ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب(MSC-Nrf2) و ترانسفکت شده با پلاسمید فاقد ژن Nrf2 (MSC-V) با استفـاده از کیـت استخـراج RNA (اینـویتروژن، آلمـان) و
جدول 1: مشخصات آغازگرهای اختصاصی طراحی شده با استفاده از وبگاه NCBI و نرم‌افزار Primer3 جهت تکثیر ژن‌های مورد مطالعه
ژن
آغازگر جلوبرنده(F)
آغازگر معکوس(R)
اندازه محصول
β-actin
GTGTTGAAGGTCTCAAACATGAT
TTCTTACAATGAGCTGCGTGTGG
bp 200
Nrf2
GTTGGCAGATCCACTGGTTTCTG
GCGACGGAAAGAGTATGAGCTGG
bp 185
NQO1
TCTCCAGGCCTTTCTTCCAT
CAGTATCCTGCCGAGTCTGT
bp 226
TXNRD1
ACTCGGTAGCCCCAATTCAA
GGTCTCGGAGGAACATGTGT
bp 194
HO-1
TTGTTGCGCTCAATCTCCTCCTC
ATGGAGCGTCCGCAACCCGAC
bp 210
GCLC
GCGATAAACTCCCTCATCCA
ACCATCATCAATGGGAAGGA
bp 182
طبق دستورالعمل استخراج گردید و کمیت RNA استخراج شده به وسیله دستگاه نانودراپ (اسپکتـا، آمریکـا) بـررسی شـد. پـس از آن بـا مقادیــر و غلظت‌های برابر از RNA استخراج شده از هر کدام از دو گروه ذکر شده، cDNA با استفاده از کیت ساخت cDNA (بایونیر، آمریکا) ساخته شد. پس از طراحی آغازگرهای اختصاصی مربوط به ژن‌های مورد مطالعه با استفاده از نرم‌افزارهای موجود مانندPrimer3 و یا سایت NCBI ، این آغازگرها بلاست شده و از نظر وجود ساختار ثانویه نیز در نرم‌افزار Genrunner مورد بررسی قرار گرفتند(جدول 1). با ایجاد شرایط دمایی و زمانی مناسب توسط دستگاه ترموسایکلر (تاکارا، ژاپن)، واکنش PCR جهت بررسی بیان ژن‌های Nrf2، TXNRD1، NQO1، GCLC و HO-1 انجام شد. به منظور بررسی صحت فرآیندها و طبیعی‌سازی بیان ژن‌ها، بیان ژن بتااکتین به عنوان ژن استاندارد نیز بررسی شد. پس از پایان واکنش PCR ، مقدار برابر از محصولات بر روی ژل آگارز 2% الکترفورز شده و با اتیدیوم بروماید رنگآمیزی شدند. باندهای ایجاد شده توسط دستگاه ژل داک ترانسلومیناتور تصویربرداری شدند.
بررسی آماری و کمی‌سازی نتایج: به منظور بهینه‌سازی شرایط ترانسفکشن و یا بررسی بیان ژن‌های مذکور با روش RT-PCR ، آزمایش‌های متعدد با ایجاد شرایط مختلف انجام شد. پس از بهینه‌سازی و به دست آوردن بهترین شرایط ممکن، کلیه آزمایش‌ها اعم از ترانسفکشن و یا بررسی بیان ژن‌ها به روش RT-PCR ، به‌صورت سه تا پنج‌تایی در هر سری کار آزمایشگاهی به طور مستقل انجام شدند. یک تصویر از بررسی بیان هرکدام از ژن‌ها به عنوان نمونه ارایه شده اما کمی‌سازی نتایج RT-PCR با استفاده از نرم‌افزار Image J 2x و تعیین میانگین و انحراف معیار شدت باندهای مشاهده شده در تصاویر گرفته شده از ژل آگارز(سه تا پنج تصویر) صورت پذیرفت. مقایسه آماری با استفاده از ANOVA انجام شده و اختلاف معنادار با ارزش p کمتر از 05/0 گزارش گردید.
یافته‌ها سلولهای بنیادی مزانشیمی کشت داده شده فیبروبلاست شکل بودند: سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف موجود در سازمان انتقال خون ایران کشت داده شدند. مشاهدات میکروسکوپی مشخص کرد که این سلول‌ها دوکی شکل و شبه فیبروبلاستی هستند(شکل1). قابلیت تمایز سلول‌ها به سه ردهی چربی، استخوان و غضروف و هم چنین بیان مارکرهای سطحی مهم سلولهای بنیادی مزانشیمی مانند CD90, CD105, CD29 و عدم بیان مارکرهای سطحی سلولهای بنیادی خونساز مانند CD34 و CD45 قبلاً تایید شده بود(29). بیان Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 افزایش داشت. پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 (pcDNA3.1-Nrf2) و پلاسمید فاقد ژن Nrf2 با استفاده از FuGENE HD به درون سلولهای بنیادی مزانشیمی ترانسفکت شدند. پس از انجام آزمایش‌های متعدد و بررسی بیان Nrf2با روش RT-PCR ، بهتریـن زمـان ترانسفکشـن کـه منجر به افزایش بیان Nrf2
شکل1: مشاهده میکروسکوپی سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف 5 روز پس از کشت آن‌ها. سلول‌ها ظاهر دوکی و شبه فیبروبلاست داشتند(بزرگنمایی × 200)
شود 72 ساعت تعیین شد. نتایج کمی‌سازی با نرم‌افزار Image J 2x ، بیانگر افزایش بیان ژن Nrf2 در زمان 72 ساعـت پس از ترانسفکشن و بعد از القای استرس UV در گروه سلولی ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب(MSC-Nrf2) نسبت به گروه سلولی ترانسفکت شده با پلاسمید فاقد ژن Nrf2 بود( 01/0(p< (شکل 2A). ژن بتااکتین به عنوان ژن استاندارد و به منظور اطمینان از درستی فرآیندهای انجام شده انتخاب شد، نتایج نشان داد که هر دو گروه این ژن را یکسان بیان کرده و اختلاف معناداری بین بیان بتااکتین در دو گروه تحت مطالعه وجود ندارد (شکل 2B). بیان ژن‌های GCLC و TXNRD1 در سلولهای
ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 افزایش داشت. هم زمان با بررسی بیان ژن محافظت سلولیNrf2در سلولهای ترانسفکت شده و استرس دیده، بیان برخی از ژن‌های پایین دست Nrf2 مانند TXNRD1 ، NQO1 ، GCLC، HO-1 نیز در این سلول‌ها مورد مطالعه قرار گرفت. پس از الکتروفورز محصولPCR و کمی‌سازی نتایج، مشخص شد که بیان ژن TXNRD1 در گروه MSC-Nrf2 (ترانسفکت شده با پلاسمید (pcDNA3.1-Nrf2 نسبت به گروه MSC-V (ترانسفکت شده با پلاسمید فاقد ژن Nrf2) افزایش داشت( 05/0(p< (شکل 3A). از طرفی همان طور که در نمودار 2 مشاهده می‌شود، بیان ژن GCLC متعاقب افزایش بیان Nrf2 در سلولهای دریافت‌کننده پلاسمید نوترکیب افزایش داشته و گروه MSC-Nrf2 این ژن را بیشتر از گروه MSC-V بیان کردند (01/0(p<(شکل 3B). از آن جا که بیان تمامی ژن‌های مورد مطالعه با استفاده از یک cDNA از هر کدام از دو گروه ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 و یا پلاسمید فاقد ژن Nrf2 بررسی شد، تصویر بررسی بیان ژن بتااکتین بر روی این cDNA ها در یک بار آزمایش ارایه شده است. اما در هر سری انجام PCR ، بتااکتین به عنوان کنترل داخلی جهت پایش درست عمل کردن کل سیستم در حین انجام واکنش مورد استفاده قرار گرفت.
شکل 2- A : بررسی بیان ژن Nrf2 در دو گروه سلولی تحت مطالعه با روش RT-PCR .M مارکر(bp 100) DNA ، ردیف MSC-V : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید خالی، ردیفMSC-Nrf2 : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید pcDNA3.1-Nrf2. گروه MSC-Nrf2 این ژن را بیشتر بیـان کـرد(01/0(p< . B : بـررسی بیان ژن بتااکتین(β-actin) در دو گروه سلولی تحت مطالعه. بیان بتااکتین در دو گروه اختلاف معنادار نداشت.
شکل 3- :A بررسی بیان ژن TXNRD1 در دو گروه سلولی تحت مطالعه با روشRT-PCR .M مارکر(bp 100) DNA ، ردیف MSC-V : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید خالی، ردیف MSC-Nrf2 : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید pcDNA3.1-Nrf2 . گروهMSC-Nrf2 این ژن را بیشتر بیان کرد( 05/0(p< . B : بـررسی بیان ژن GCLC در دو گروه سلولی تحت مطالعه با روشRT-PCR .M مارکر(bp 100) DNA ، ردیف MSC-V : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید خالی، ردیف MSC-Nrf2 : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید .pcDNA3.1-Nrf2 گروه MSC-Nrf2 این ژن را بیشتر بیان کرد( 01/0(p< .
شکل 4- A : بررسی بیان ژن HO-1 در دو گروه سلولی تحت مطالعه با روشRT-PCR .M مارکر(bp 100) DNA ، ردیف MSC-V : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید خالی، ردیف MSC-Nrf2 : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید pcDNA3.1-Nrf2 . هر دو گروه این ژن را بیان نکردند. :B بررسی بیان ژن NQO1 در دو گروه سلولی تحت مطالعه با روشRT-PCR .M مارکر(bp 100) DNA ، ردیف MSC-V : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید خالی، ردیف MSC-Nrf2 : MSCs ترانسفکت شده با پلاسمید pcDNA3.1-Nrf2 . هر دو گروه این ژن را بیان نکردند.
افزایش بیان Nrf2 بر بیان ژن‌های HO-1و NQO1تاثیری نداشت: پس از افزایش بیان Nrf2 ، بیان ژن‌های HO-1 و NQO1 نیز مورد بررسی قرار گرفت. با بررسی بیان ژن HO-1 و الکتروفورز محصول PCR و کمی‌سازی نتایج، هیچ گونه باندی در هر دو گروه سلولهای بنیادی مزانشیمی(MSC-Nrf2 و MSC-V) مشاهده نشد و بیان ژن HO-1 در MSC ترانسفکت شده با پلاسمید نوترکیب حاوی ژن Nrf2 با بیان آن در MSC ترانسفکت شده با پلاسمید فاقد ژن Nrf2 تفاوتی نداشت. ژن NQO1 نیز در دو گروه سلولهای بنیادی مزانشیمی بیان نشد و بیان ژن NQO1 در دو گروه تحت مطالعه اختلاف معناداری را نشان نداد(شکل 4 A و B). در کل با توجه به نتایج به دست آمده مشخص شد که متعافب افزایش بیان Nfr2 برخی از ژن‌های زیر دست آن مانند GCLC , TXNRD1 نیـز بیان بیشتری داشته ولـی بیـان ژنهایی مانندHO-1, NQO1 تغییری ندارد.
شکل 5 : نقشه پلاسمید pcDNA3.1 استفاده شده در این مطالعه
بحث سلولهای بنیادی مزانشیمی به دلیل جداسازی آسان و توانایی تمایز مناسب، کاربردهای مختلفی در پزشکی دارند (7، 6). با این وجود طی فرآیندهای جمع‌آوری، کشت و پردازش، آسیبهای متعددی به سلولهای بنیادی مزانشیمی وارد می‌شود که بقا و عملکرد آن‌ها را کاهش میدهد(8). بنابراین مطالعه‌های متعددی در زمینه افزایش بقای سلولهای بنیادی مزانشیمی صورت گرفته است(32-30). در این مطالعه بیان ژن Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف افزایش داده شد. به دلیل اهمیت زیاد این ژن که از ژن‌های اصلی دخیل در حفظ سلول‌ها در شرایط استرس است، بیان آن در سلولهای بنیادی مزانشیمی افزایـش داده شـد. ژن Nrf2 بیـان‌کننده پروتئیـن Nrf2 می‌باشد که یک فاکتور نسخه‌برداری حساس به اکسیداسیون و احیا است و به عنوان فاکتور رونویسی به عناصـر تنظیمـی کــه در فـرادسـت بسیـاری از ژنهــای محافظت‌کننده سلولی قرار دارند، متصل شده و منجر به بیان این ژن‌ها می‌شود. پروتئین Nrf2 در مقایسه با دیگر ژن‌های مؤثر در حفاظت از سلول این مزیت را دارد که منجر به افزایش بیان هم زمان مجموعهای از ژن‌های محافظت‌کننده سلولی می‌گردد(18-14، 12، 10). در این مطالعه از MSCs بند ناف استفاده شد. نمونه بند ناف یک نمونه قابل دسترس با نمونهگیری آسان و غیر تهاجمی است که از نظر اخلاقی نیز مشکلی ندارد(33). از طرفی سلولهای بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت بند ناف دارای قدرت تکثیر و کلونیزایی بیشتر بوده و خاصیت چندتوانی بیشتری دارند(35، 34). در مطالعه اخیر جهت افزایش بیان ژن Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی بند ناف، از حامل پلاسمیدی(pcDNA3.1) و ماده (FuGENE HD) استفاده شد. pcDNA3.1 یک شاتل وکتور است به این معنی که امکان کلونینگ آن در سیستم پروکاریوتی و بیان آن در سیستم یوکاریوتی وجود دارد (36). نقشه پلاسمید pcDNA3.1 در شکل 5 ارایه شده است. استفاده از حامل پلاسمیدی(به جای حامل ویروسی) نگرانی از واکنش‌های ایمنی غیر اختصاصی و یا جهش‌زایی را به همراه ندارد(37). ماده FuGENE HD باعث افزایش درصد انتقال DNA به داخل سلول شده و بر روی تکثیر و تمایز سلولی اثر منفی ندارد(38). نتایج مطالعه بیانگر افزایش بیان ژن‌های TXNRD1 و GCLC (از مجموعه ژن‌های پایین دست Nrf2) متعاقب افزایش بیان Nrf2 در سلولهای ترانسفکت شده بود. اما افزایش بیان Nrf2 بر بیان دو ژن HO-1و NQO1اثری نداشت. در این مطالعه تغییر بیان ژن‌ها فقط به روش RT-PCR بررسی شد و در نهایت با استفاده از نرم‌افزار Image J2x نتایج کمی‌سازی شد. هر چند به منظور بررسی میزان بیان ژن‌ها بهتر است از روش‌های کمی مانند Real Time PCR با استفاده از رنگ فلورسنت سایبرگرین و یا مواد دیگر استفاده شود اما محدودیت‌های زمانی و مالی موجب عدم استفاده از روش‌های تاییدی بیشتر در بررسی بیان این ژن‌ها شد که این مورد از مهم‌ترین محدودیت‌های این مطالعه می‌باشد. محمدزاده و همکاران در سال 2012 گزارش کردند که افزایش بیان ژن Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی باعث افزایش بیان SOD1&2(Superoxide desmutase1& 2) در این سلول‌ها و افزایش مقاومت سلولی و کاهش آپوپتوز آن‌ها می‌شود(26). آن‌ها از وکتور ویروسی جهت انتقال ژن Nrf2به سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان استفاده کردند. به نظر می‌رسد در مطالعه وی استفاده از وکتور ویروسی باعث افزایش درصد انتقال ژن و افزایش بیان بیشتر Nrf2 در سلولهای تحت مطالعه نسبت به تحقیق اخیر شده است. در مطالعه‌های مختلف از وکتورهای ویروسی و غیر ویروسی جهت آلوده کردن سلولهای هدف به سازه حاوی ژن استفاده می‌شود. استفاده از وکتورهای ویروسی مانند رتروویروسها، آدنوویروسها و لنتی ویروسها مرسوم می‌باشد. اما کاربرد آن‌ها همیشه با نگرانی از ورود ژن به ژنوم، ایجاد عفونت، ایجاد پاسخ ایمنی نسبت به وکتور ویروسی و ایجاد سرطان همراه بوده است(40-38). لوونن در سال 2007 با استفاده از وکتور ویروسی بیان Nrf2 را در سلولهای عضله صاف عروقی افزایش داد و چنین گزارش کرد که این سلول‌ها در بیماری عروقی که با التهاب و استرس اکسیداتیو زیادی همراه است، مقاومت سلولی بیشتری داشته و کمتر آسیب می‌بینند(27). در مطالعه دیگر کائو و همکاران از افزایش بیان Nrf2 به منظور توانمندسازی سلول‌ها در برابر استرس اکسیداتیو استفاده کردند(28). در مطالعه آن‌ها از رده سلولی نروبلاستومایی استفاده شده بود که بعد از افزایش بیان Nrf2 در این سلول‌ها، مقاومت آن‌ها در برابر استرس ناشی از رادیکالهای آزاد اکسیژن ارتقا یافت. در مطالعه اخیر از سلولهای بنیادی مزانشیمی به‌عنوان سلولهای اولیه چند توان که می‌توانند کاربردهای بیشتری داشته باشند استفاده شد. رده‌های سلولی، سلولهای اولیه نبوده و یک سری دست‌ورزی‌های مختلف بر آن‌ها اعمال شده است. در مطالعه‌های دیگر بیان شده است که Nrf2 موجب افزایش نسخه‌برداری ARE شده و بدین وسیله باعث تقویت بیان آنزیم‌های حفاظت‌کننده سلولی و آنتی‌اکسیدان وابسته به ARE از جمله HO-1 ، SOD1&2 ، GCLC ، GPx ، NQO1 می‌شود(43-41). در مقابل نتایج مطالعه اخیر نشان داد که افزایش بیان Nrf2 بر بیان NQO1 اثری نداشته است. استفاده از سلولهای بنیادی مختلف جدا شده از بافتهای گوناگون و به کارگیری روش‌های مختلف جهت افزایش بیان Nrf2 با درصد اختصاصیت و حساسیت متفاوت، می‌تواند از دلایل احتمالی تفاوت در نتایج گزارش شده باشد. در کل، نتایج مطالعه اخیر تا حدودی در راستای مطالعه‌های موجود بوده و با افزایش بیان برخی ژن‌های محافظت سلولی همراه بود که به نظر می‌رسد در نهایت باعث افزایش مقاومت سلولی و کاهش مرگ سلولهای بنیادی مزانشیمی در مراحل سلول درمانی شود. البته انجام مطالعه‌های بیشتر، بررسی کمی تغییرات بیان ژن‌ها با روش‌هایی مانند Real Time PCR ، بررسی بیان این ژن‌ها در سطح پروتئین و بررسی میزان بقا و مقاومت سلولی گروه ترانسفکت شده با وکتور نوترکیب در مواجهه با استـرس‌های مختلـف به منظور تایید افزایش مقاومت آن‌ها می‌تواند تکمیل کننده این مطالعه باشند.
نتیجه‌گیری افزایش بیان Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی موجب بیان بیشتر ژن‌های GCLC و TXNRD1 در این سلول‌ها شده و به نظر می رسد بخشی از نقش حفاظت سلولی Nrf2 تحت تاثیر بیان این ژن‌ها باشد که نیازمند
مطالعه‌ها و تحقیقات آتی و جامع است.
تشکر و قدردانی این مقاله حاصل پایان نامه کارشناسی ارشد مصوب دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شرق می‌باشد که در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون، مؤسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون انجام پذیرفته است.
Mehrabi Habibabadi H, Amiri F, Moslemi E, Habibi Roudkenar M, Jalili M. Overexpression of Nrf2 in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells upregulating cytoprotective genes, TXNRD1 and GCLC. Sci J Iran Blood Transfus Organ 2015; 12 (3) :255-265 URL: http://bloodjournal.ir/article-1-932-fa.html
مهرابی حبیب‌آبادی حسین، امیری فاطمه، مسلمی الهام، حبیبی رودکنار مهر، جلیلی محمدعلی. بررسی بیان ژن‌های حفاظت سلولی TXNRD1 و GCLC پس از افزایش بیان Nrf2 در سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بند ناف . فصلنامه پژوهشی خون. 1394; 12 (3) :255-265
